Оптимизация удобных машин ПЦР в реальном времени

Если это количественная ПЦР в реальном времени для количественного определения вируса и генотипирования SNP, нам нужна машина для ПЦР с максимально возможной специфичностью; Если это обнаружение патогена и мРНК, нам нужна высокая чувствительность Машина ПЦРТак как мы должны оптимизировать эту машину для ПЦР?

Вот список контента:

L Повышение эффективности усиления машины ПЦР

l Использование машин для ПЦР в реальном времени для общей ПЦР

Повышение эффективности усиления машины ПЦР

Улучшить Машина ПЦР Эффективность, специфичность и чувствительность усиления, мы можем оптимизировать флуоресцентную количественную ПЦР-машину в реальном времени для эксперимента посредством ряда мер. Первый - это выбор целевой последовательности.

1, выбор удобной последовательности целевой последовательности машины ПЦР в реальном времени соответствующая длину от 50 до 150 п.н.. Более короткие последовательности требуют меньше времени, чтобы синтезировать и иметь более короткое время амплификации, поэтому возможность загрязнения ДНК увеличивается, снижается.

2, при выборе целевой последовательности используйте поиск взрыва для анализа целевой последовательности для полиморфизмов и ошибок секвенирования и избегайте их. Если в целевой последовательности есть дубликаты последовательностей, это снизит чувствительность обнаружения этой машины ПЦР, а также следует избегать.

3, контроль содержимого GC ≤ 60% в целевой последовательности. Высокое содержание GC, повлияет на денатурацию целевой последовательности в тепловом цикле, но также и легко создавать эту не специфическую амплификацию этого машины для ПЦР.

4, избегайте генерирования вторичной структуры. Целевые последовательности с обратными повторяющимися последовательностями легко создавать вторичную структуру, которая влияет на гибридизацию удобных машин ПЦР в реальном времени.

В дополнение к этому нам также необходимо гарантировать, что качество шаблона не повлияет на усиление, результаты удобной ПЦР-машины в реальном времени наделены. Например, поврежденная ДНК не может быть адекватно усилена в машине ПЦР или вообще не усилена. Кроме того, присутствие реагентов, ингибирующей ДНК -полимеразы (ДМСО и т. Д.) И загрязняющих веществ (SDS и т. Д.) В шаблоне может повлиять на надежность результатов амплификации машины ПЦР.

Использование праймеров для ПЦР в реальном времени для общей ПЦР

Получите удобное в режиме реального времени Машина ПЦР Праймеры, этот метод также может быть использован для обычной ПЦР.

1, длина должна быть 18-30bp, чтобы обеспечить специфичность связывания.

2, температура плавления (значение TM) должна составлять 55-60 ° C, а значения TM двух праймеров должны отличаться на 2-3 ° C.

3, каждый праймер должен иметь от 1 до 3 гуанинов или цитозинов на 3 'конец, что может удобно уменьшить неспецифическое усиление во время машины ПЦР в режиме реального времени. Более 3 будут иметь неприятные последствия и вызовут "скользящий эффект ", что приведет к неправильному расширению.

4. Содержание GC в праймерах должно составлять около 50%, слишком высокое содержание GC увеличит значение TM.

5, машины ПЦР должны избегать обратных повторяющихся последовательностей, потому что они будут образовывать вторичную структуру, влияя на связывание праймера на шаблоне.

6, если это RT-PCR, вам также необходимо избегать проектирования праймеров для связывания на последовательностях экзонов, что приведет к ложноположительно-положительным результатам экспериментальной машины для ПЦР. Правильный подход должен быть спроектирован на длинном фланге интрона, или в коротких интронах, или в области соединения экзон-экзон.

7. Опаление и очищение праймеров.

Обратите внимание, что иногда, когда вы делали все точки, праймеры могут не усилить, поэтому вы должны перепроектировать праймеры.

Сосредоточив внимание на быстрого обнаружения нуклеиновых кислот и быстрого обнаружения POCT, Bioteke предлагает виды лабораторных инструментов в качестве: сбора отбора проб вируса, экстрактора автоматического нуклеиновой кислоты, машины для ПЦР и дезинфекции. И это также предоставляет много видов реагентов и наборов.